一、實驗原理
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA）一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，現(xiàn)已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者單鏈。當(dāng)檢測 如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白或核細胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點和強度來確定特異結(jié)合。
二、應(yīng)用簡介
1.研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用；
2.可用于DNA定性和定量分析；
3.用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
三、實驗方法
四、樣本送檢要求
五、 案例展示
六、常見問題
1. 凝膠遷移實驗在理論上很簡單也很快速，但要成功地進行凝膠遷移實驗，需要優(yōu)化一些參數(shù)，這主要受結(jié)合蛋白的來源和探針結(jié)合位點特點的影響。以下是需要優(yōu)化的因素：抽提液的制備（核酸酶和磷酸酶污染會使探針降解），結(jié)合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配方和pH，聚丙烯凝膠電泳的特點和電泳條件，保溫時間和溫度，載體蛋白，是否有輔助因子（比如鋅，或鎘等金屬離子，或激素）?？傊?，反應(yīng)總體積應(yīng)最?。?0μl）。為滿足一般要求，結(jié)合緩沖液含4%甘油，1mM MgCl2，0.5mM EDTA，0.5mM DTT，50mM NaCl，10mM Tris-HCl（pH7.5），0.05mg/ml poly dI:dC，或10mM HEPES（pH7.9），50mM KCl，1mM DTT，1mM EDTA，10%甘油，0.05mg/ml poly dI:dC可作為優(yōu)化實驗的起始。
2. 在DNA探針的選擇上，要考慮的重要因素：目的DNA的長度應(yīng)小于300bp，以有利于非結(jié)合探針和蛋白DNA復(fù)合物的電泳分離。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實驗中用作探針。如目的蛋白已被鑒定，則應(yīng)用短的寡核苷酸片段（約為25bp），這樣結(jié)合位點可和其他因子的結(jié)合位點區(qū)別開。長的限制性酶切片段可用于對推定的啟動子/增強子區(qū)域內(nèi)的蛋白結(jié)合位點定位。隨后可用DNaseI印跡對蛋白結(jié)合的特異區(qū)域在DNA序列水平上作出分析。
3. 用以下一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和HeLa細胞核抽提物可形成哪些復(fù)合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。
4. 當(dāng)用HeLa細胞核抽提物作為結(jié)合蛋白的來源時，每1個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和它相關(guān)的DNA同源序列結(jié)合形成特征型的結(jié)合形態(tài)。以下的文字描述了每一個單獨的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括識別的同源序列，因子的大小，特定的結(jié)合條件，以及和HeLa細胞核抽提物可形成的復(fù)合物的數(shù)目。
七、服務(wù)流程
病理學(xué)檢測
分子生物學(xué)檢測
免疫學(xué)檢測服務(wù)
細胞實驗服務(wù)
動物實驗平臺
