一、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30%的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。
TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。
過氧化物酶標(biāo)記測定法原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報(bào)告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結(jié)合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確的定位出正在凋亡的細(xì)胞，因而可在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。
毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動(dòng)物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結(jié)合的配體，因而非特異性反應(yīng)很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動(dòng)物甾體激素的交叉反應(yīng)不到1％，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細(xì)胞Fc受體非特異性的吸附作用。
二、應(yīng)用簡介
本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細(xì)胞凋亡測定，還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià)，以及通過雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段。
三、實(shí)驗(yàn)流程
四、 樣本送檢要求
五、 案例展示
六、常見問題
1、出現(xiàn)非特異性熒光標(biāo)記
① 有些細(xì)胞或組織，例如平滑肌細(xì)胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的熒光標(biāo)記。解決方法是，取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽性。
② 使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?，例如一些酸性固定液，?dǎo)致出現(xiàn)假陽性。建議采用推薦的固定液。
③ TUNEL檢測反應(yīng)時(shí)間過長，或TUNEL檢測反應(yīng)過程中反應(yīng)液滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現(xiàn)非特異性熒光。注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保TUNEL檢測反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。
2、熒光背景很高
① 支原體污染。請(qǐng)使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。
② 高速分裂和增殖的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂。
③ TUNEL反應(yīng)過強(qiáng)?？梢杂?/span>試劑盒提供的TdT酶稀釋液稀釋TdT酶2-5倍后再按照說明書操作。稀釋后的TdT酶需當(dāng)日使用。
④ 紅細(xì)胞中血紅蛋白導(dǎo)致的自發(fā)熒光產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。此時(shí)宜選擇其它細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。
3、標(biāo)記效率低
① 使用乙醇或甲醇固定會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的效率較低。
② 固定時(shí)間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高。此時(shí)宜減少固定時(shí)間。
③ 熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會(huì)嚴(yán)重淬滅。解決方法是需注意避光操作。
④ 碘化丙啶雙染時(shí)，如果碘化丙啶染色過深會(huì)導(dǎo)致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發(fā)產(chǎn)生的熒光，從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。
七、服務(wù)流程
病理學(xué)檢測
分子生物學(xué)檢測
免疫學(xué)檢測服務(wù)
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)服務(wù)
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)
