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一、實(shí)驗(yàn)原理

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是一項(xiàng)新型的、發(fā)展迅速的生物醫(yī)學(xué)分析技術(shù),它是集激光技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)以及細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù) 、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技細(xì)胞分析技術(shù)。

流式細(xì)胞儀是應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)建立起來(lái)的儀器裝置。它使細(xì)胞或微粒在液流中流動(dòng),逐個(gè)通過一入射光束,并用高靈敏度檢測(cè)器記錄下散射光及各種熒光信號(hào),從而得以對(duì)粒子進(jìn)行多參數(shù)分析,包括諸如粒子形狀和大小、細(xì)胞周期、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子、細(xì)菌表面抗原、細(xì)胞DNA內(nèi)含物等。FCM檢測(cè)的粒子一般為活性細(xì)胞,通過激光光源激發(fā)細(xì)胞上所標(biāo)記的熒光物質(zhì)的強(qiáng)度和顏色以及散射光的強(qiáng)度可以得到細(xì)胞內(nèi)部各種各樣的生物信息。另外FCM還可進(jìn)行細(xì)胞分選,可以根據(jù)所檢測(cè)細(xì)胞的某種性質(zhì)進(jìn)行分選,并且如果分選的過程是在無(wú)菌條件下進(jìn)行的,這些細(xì)胞還可以用來(lái)培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀原理如下：

待測(cè)樣品(如細(xì)胞、染色體、精子或細(xì)菌等)經(jīng)熒光染料染色后制成樣品懸液，在一定壓力下通過殼液包圍的進(jìn)樣管而進(jìn)入流動(dòng)室，排成單列的細(xì)胞，由流動(dòng)室的噴嘴噴出而成為細(xì)胞液流，并與入射激光束相交。細(xì)胞被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，由放在與入射的激光束和細(xì)胞液流成 90°處的光學(xué)系統(tǒng)收集之。光學(xué)系統(tǒng)中的阻斷濾片用于阻擋激發(fā)光；二色分光鏡及另一些阻斷濾片則用于選擇熒光波長(zhǎng)。熒光檢測(cè)器為光電倍增管。散射光檢測(cè)器是光電二極管，用以收集前向散射光。小角度前向散射與細(xì)胞大小有關(guān)。

整個(gè)儀器用多道脈沖高度分析器處理熒光脈沖信號(hào)和光散射信號(hào)。測(cè)定的結(jié)果用單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、三維立體圖和輪廓（等高）圖來(lái)表示。
    對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選的原理是，由超聲振蕩器產(chǎn)生高頻振蕩，使流動(dòng)室發(fā)生振動(dòng)，把噴嘴噴出的細(xì)胞液流斷裂成一連串的均勻小液滴，有的液滴含有細(xì)胞。這些細(xì)胞在形成液滴前，光學(xué)系統(tǒng)已測(cè)定了它們的信號(hào)（代表細(xì)胞的性質(zhì)），如果測(cè)得信號(hào)與所選定的要進(jìn)行分選的細(xì)胞性質(zhì)符合，或者說(shuō)，如果發(fā)現(xiàn)了要進(jìn)行分選的細(xì)胞時(shí)則在這個(gè)選定細(xì)胞剛形成液滴時(shí)，儀器給整個(gè)液流充以短暫的正或負(fù)電荷。當(dāng)該液滴離開液流后，其中被選定細(xì)胞的液滴就帶有電荷，而不被選定的細(xì)胞液滴則不帶電。帶有正電或負(fù)電的液滴通過高壓偏轉(zhuǎn)板時(shí)發(fā)生向陰極或向陽(yáng)極的偏轉(zhuǎn)，從而達(dá)到了分類收集細(xì)胞的目的。

二、應(yīng)用簡(jiǎn)介

醫(yī)學(xué)應(yīng)用

1. HIV免疫分型，CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)

2. 白血病和淋巴瘤的免疫分型

3. 腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析

4. 網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)

5. 細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)

6. 干細(xì)胞計(jì)數(shù)

7. 殘量白血病細(xì)胞檢查

8. HLA-B27檢查

9. 血小板功能及相關(guān)疾病

科研應(yīng)用

1. 在免疫研究學(xué)中的應(yīng)用：

結(jié)合免疫熒光方法，流式細(xì)胞術(shù)可辨認(rèn)和計(jì)數(shù)帶有不同表面特異性抗原的細(xì)胞，例如用熒光素標(biāo)記的免疫球蛋白鑒別T和B淋巴細(xì)胞（圖3），根據(jù)細(xì)胞表面抗原的不同,進(jìn)一步分辨出不同的T和B淋巴細(xì)胞亞群，以及測(cè)定每個(gè)細(xì)胞所帶抗原的數(shù)量、密度及其動(dòng)力學(xué)參數(shù)等。也可用流式細(xì)胞分選技術(shù)將帶有“＋”和不帶有“－”的某種特異抗原的細(xì)胞群體分類收集，供研究其功能特性。

流式細(xì)胞術(shù)對(duì)于判斷免疫缺陷癥，如愛滋?。ǐ@得性免疫缺損綜合征）的重要特征，即T4和T8淋巴細(xì)胞比例改變（T4細(xì)胞大量減少）以及判斷自身免疫病和確定白血病、淋巴癌的表型等，都是非常有用的。此外，流式細(xì)胞術(shù)還可用于定量分析結(jié)合于細(xì)胞上的熒光素標(biāo)記的外源凝集素，測(cè)定細(xì)胞表面積和熒光素結(jié)合位點(diǎn)的相對(duì)密度，結(jié)合細(xì)胞動(dòng)力學(xué)測(cè)定每個(gè)細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目，以及研究各種外源凝集素與細(xì)胞表面結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性等。

2. 在神經(jīng)生物學(xué)研究中的應(yīng)用：神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的特性研究；不同類型的神經(jīng)細(xì)胞的鑒定和功能研究；檢測(cè)細(xì)胞活性，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等。

3. 在腫瘤研究中的應(yīng)用：

腫瘤細(xì)胞一般都含有異常數(shù)量的 DNA。在大多數(shù)實(shí)體瘤和急性白血病中都發(fā)現(xiàn)有非整倍體的細(xì)胞，由于流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果精確，能快速得到有關(guān)DNA倍性的信息,因而能提供有價(jià)值的診斷數(shù)據(jù)。如果在測(cè)量 DNA含量的同時(shí)，再測(cè)定其他參數(shù)（如不同類型的中等纖維蛋白，蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞大小、核質(zhì)比等）則可進(jìn)一步提高診斷的可靠性。
   流式細(xì)胞術(shù)可在實(shí)驗(yàn)和臨床中評(píng)價(jià)腫瘤化療和放療的作用，現(xiàn)在根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)監(jiān)視腫瘤治療的工作已經(jīng)在實(shí)際工作中開展起來(lái)。
   此外，流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域中也得到廣泛的應(yīng)用。流式細(xì)胞術(shù)正在向高靈敏、高速度、多參數(shù)測(cè)量、獲取形態(tài)學(xué)信息等方面發(fā)展。

4. 在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用：

流式細(xì)胞術(shù)可用于測(cè)定細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞的百分比。通過測(cè)定細(xì)胞群體中每個(gè)細(xì)胞的DNA含量，得出DNA含量分布曲線。例如，在測(cè)定Hela細(xì)胞DNA含量分布曲線上，第一個(gè)峰是含有2CDNA含量的G1/G0（DNA合成前期/靜止期）細(xì)胞,其次一個(gè)峰是4CDNA含量的G2+M(DNA合成后期＋有絲分裂期)細(xì)胞，從2C～4C間的區(qū)域?yàn)镾期（DNA合成期）細(xì)胞。采用繪圖法或計(jì)算機(jī)擬合法可計(jì)算出細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞占整個(gè)細(xì)胞群體的百分?jǐn)?shù)。
    用流式細(xì)胞術(shù)可進(jìn)行多參數(shù)分析，即同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞的多種性質(zhì)。如散射光和熒光，或多種不同顏色的熒光。例如細(xì)胞經(jīng)吖啶橙染色后，DNA發(fā)綠色熒光，RNA發(fā)紅色熒光。測(cè)定這兩種熒光就能同時(shí)得知一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA含量。測(cè)定結(jié)果可用二維散點(diǎn)圖或三維立體圖表示。用這種方法可根據(jù)DNA和RNA含量而鑒別出G0與G1、M期和 G2期細(xì)胞。用流式細(xì)胞術(shù)與液體閃爍技術(shù)相配合,還可求得細(xì)胞通過G1、S和G2+M期的時(shí)間(T、Ts、T+M及其變異系數(shù)。近年利用抗溴脫氧尿苷(Brdurd)單克隆抗體能發(fā)現(xiàn)滲入到細(xì)胞 DNA內(nèi)的溴脫氧尿苷。將此種熒光抗體技術(shù)與測(cè)定細(xì)胞 DNA含量相結(jié)合，是研究DNA合成和細(xì)胞周期的一種非常有用的技術(shù)。此外,流式細(xì)胞術(shù)還可測(cè)定細(xì)胞群體同步化的程度和所處的時(shí)期，鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞，利用熒光標(biāo)記配體，還可定量測(cè)定細(xì)胞表面和內(nèi)部的受體等。

5. 在高通量監(jiān)測(cè)和新藥研發(fā)中的應(yīng)用：細(xì)胞功能變化的研究；細(xì)胞周期和活性；新藥研發(fā)；培養(yǎng)基研發(fā)等。

6. 海洋生物學(xué)：富集和分析細(xì)菌、藻類、浮游植物等。

7. 微生物學(xué)：細(xì)菌和酵母檢測(cè)；熒光蛋白檢測(cè)。

8. 生物燃料

9. 遺傳學(xué)研究：

用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定染色體DNA含量,可得到染色體頻率分布圖，稱為流式染色體核型分析。同類型染色體出現(xiàn)一個(gè)峰，峰的面積代表這種類型染色體的豐度。流式染色體核型分析技術(shù)不僅能快速分析核型，而且能分選出不同類型的染色體,做成人類每條染色體的DNA文庫(kù)，可用于人類基因組研究、遺傳病和癌癥的診斷的研究。

三、實(shí)驗(yàn)方法

Step1：制成單細(xì)胞懸液（組織樣本）

Step2：溶血（細(xì)胞樣本無(wú)需進(jìn)行此步驟）

Step3：離心去上清

Step4：調(diào)整細(xì)胞密度

Step5：加入相應(yīng)的標(biāo)記抗體

Step6：孵育

Step7：洗滌后離心去上清

Step8：上機(jī)檢測(cè)

四、樣本送檢要求

五、案例展示

六、常見問題

1. 待測(cè)樣本量至少lml，樣本應(yīng)在采集后6h內(nèi)處理，不可使用冷凍的標(biāo)本或溶血樣本。

2. 細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。

3. 確保標(biāo)本上機(jī)檢測(cè)前的細(xì)胞濃度為1×106／ml，細(xì)胞濃度過低則直接影響檢測(cè)結(jié)果。

4. 操作方面，保證流式細(xì)胞儀在整個(gè)工作過程中處于最佳狀態(tài)，能保證定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性和檢測(cè)精度。使用標(biāo)準(zhǔn)樣品調(diào)整儀器的變異系數(shù)在最小范圍，分辨率在最好狀態(tài)，能避免在測(cè)量過程中儀器條件的變化引起的檢測(cè)誤差。

5. 在紅色熒光對(duì)藍(lán)色熒光散點(diǎn)圖上，還可見到細(xì)胞凋亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細(xì)胞的DNA進(jìn)一步降解的緣故。

6. 用Heochst 33342染料與細(xì)胞孵育的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一般控制在20min之內(nèi)為宜。如果太長(zhǎng)可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移，導(dǎo)致紅色熒光與藍(lán)色熒光的比例改變，從而影響結(jié)果的判斷。

七、 服務(wù)流程