一、實驗原理
Southern blot又稱凝膠電泳壓印雜交技術(shù),該方法利用硝酸纖維膜或濾紙或尼龍膜等具有吸附DNA的功能,先將DNA片段作凝膠電泳,并將電泳后的DNA區(qū)帶吸附到膜上,然后直接在膜上進行同位素標(biāo)記探針與被測DNA之間的雜交,最后通過放射自顯影對雜交結(jié)果進行檢測,以此探測一個DNA樣品中含有的特定DNA序列。
Southern雜交技術(shù)是由Edward?M.?Southern在1975年首先發(fā)明的用于檢測DNA的一種核酸雜交技術(shù)，并因此而得名。其原理是根據(jù)毛細管作用的原理，將在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過與標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用，檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段。
主要步驟包括將基因組DNA進行限制性內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)堿變性等預(yù)處理之后，平鋪在已用電泳緩沖液飽和了的兩張濾紙上，在凝膠上部覆蓋一張硝酸纖維素濾膜，接著加一疊干濾紙，然后再壓蓋一重物。由于干濾紙的吸引作用，凝膠中的單鏈DNA便隨電泳緩沖液一起轉(zhuǎn)移。這些DNA分子一旦與硝酸纖維素濾膜接觸，便會牢牢地與之結(jié)合，而且是嚴格按照它們在凝膠中的譜帶模式，原樣地被吸印到濾膜上。在80℃下烘烤12h，DNA片段就會被穩(wěn)定地固定在硝酸纖維素濾膜上。然后將此濾膜移放在加有標(biāo)記探針的溶液中進行核酸雜交，漂洗去游離的沒有雜交上的探針分子，用適當(dāng)?shù)姆绞斤@色，與溴化乙錠染色的凝膠譜帶作對照比較，便可鑒定出與探針具有同源性的限制片段的大小和位置。
二、應(yīng)用簡介
技術(shù)應(yīng)用
1、定性及定量分析基因組中特定基因；
2、基因突變分析及限制性片段長度多態(tài)性分析。
應(yīng)用范圍
1.遺傳病診斷：傳統(tǒng)的基因診斷技術(shù)主要是以基因探針技術(shù)為基礎(chǔ)而建立的一些檢測方法-Southern blot。
2.DNA圖譜分析：a.高度的特異性；b.穩(wěn)定的遺傳性；c.體細胞穩(wěn)定性
3.檢測樣品中的DNA及其含量
4.PCR產(chǎn)物分析
三、 實驗方法
四、樣本送檢要求
五、案例展示
六、常見問題
1、針對不同的實驗材料，southern雜交實驗難度有差異么？
答：不同的實驗材料，在進行試驗過程中難度差異很大，例如玉米、小麥、葡萄的Southern雜交檢測難度要比普通的材料要大。
(1)、物種本身的基因組較大（例如小麥），檢測操作難度大
(2)、材料本身含有高糖多酚（例如葡萄）嚴重影響酶切操作
(3)、物種品系復(fù)雜（例如玉米），在基因組信息研究層面還不透徹。
2、核酸質(zhì)量對southern雜交實驗的影響
答：核酸質(zhì)量對實驗的影響是直接的，既要求客戶提供的總量足夠——實驗消耗（上樣量），又要求保證質(zhì)量——按要求準備材料。
上樣量指的是基因組DNA酶切消化后，回收后的DNA片段的量。根據(jù)不同物種的基因組大小不同，上樣量也有所區(qū)別?；蚪M越大，上樣量越多。例如，擬南芥大概需要3ug，酵母3ug，人8ug，小麥15ug。酶切消化之后不能直接上樣，需要回收純化。回收會有損失，最多能損失一半，所以需要客戶提供足夠量的樣品，一般要求至少20 ug的基因組DNA。（以上上樣量均為一個泳道）
DNA樣品一般對OD值和濃度有如下要求：OD260/280=1.8～2.0，OD260/230＞2.0，濃度≥100 ng/ul。同時，需要對DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示該DNA樣品無蛋白質(zhì)和RNA等物質(zhì)污染，無降解彌散，條帶清晰。
3、探針設(shè)計是怎么回事，有哪些原則？
答：探針就是與待測目的基因序列同源的一段地高辛標(biāo)記的DNA序列，可以和酶切后的基因組片段特異性的結(jié)合。 探針設(shè)計有如下幾個原則:
(1)、長度適中。探針的片段長度一般控制在300-1000bp，探針太長時會導(dǎo)致非特異性結(jié)合的概率增加，探針太短時，探針結(jié)合的地高辛標(biāo)記物太少，會導(dǎo)致發(fā)光信號減弱。
(2)、特異性強。最佳的探針序列是僅與目的基因同源，與整個基因組序列的同源片段低于30%。
(3)、ATGC含量均勻，無發(fā)卡結(jié)構(gòu)和高度重復(fù)序列。
4、基因組片段化時使用限制性內(nèi)切酶是怎么選擇的？
答：(1)、目的基因序列中不能含有該位點
(2)、常用的內(nèi)切酶，價格優(yōu)惠、酶切效率高
(3)、預(yù)實驗可以把基因組片段化，電泳檢測彌散狀態(tài)看不到明顯的主帶。
(4)、根據(jù)轉(zhuǎn)化載體上的酶切位點選擇
5、如何減少非特異的曝光條帶？
我們采用PCR法合成雙鏈的地高辛標(biāo)記的探針，電泳檢測探針是否標(biāo)記成功，若條帶單一，且略大于對照組，則認為探針合成成功（如圖3所示）。
此外，和合成探針前，需要在NCBI上比對探針序列，若沒有在待測物種中Blast到高同源性的序列，則認為該探針是特異的。
6、檢測結(jié)果陰性有哪些因素造成的？
答：在southern雜交服務(wù)中，大概總結(jié)為一下幾類原因：
(1)、基因組中目的基因豐度很低，低于southern blot雜交實驗的檢測下限（目的基因的量低于0.1pg）
(2)、在該物種基因組信息不全的狀態(tài)下，探針序列特異性很難保證，結(jié)果出現(xiàn)大量的非特異性條帶。
(3)、基因組質(zhì)量達不到要求
(4)、待測樣品的確為陰性
(5)、酶切方案的影響
七、服務(wù)流程
病理學(xué)檢測
分子生物學(xué)檢測
免疫學(xué)檢測服務(wù)
細胞實驗服務(wù)
動物實驗平臺
