一、實驗原理
利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase）的上游， 構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響。
同時，為了減少內(nèi)在的變化因素，比如：培養(yǎng)細胞的數(shù)目、細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等對實驗準確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinilla luciferase）的質(zhì)粒（phRL-TK）作為對照質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，提供轉(zhuǎn)錄效率的內(nèi)對照，使測試結(jié)果不受實驗條件變化的干擾。
在測量過程中，首先加入熒光素酶檢測試劑Luciferase Assay Reagent II時產(chǎn)生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶活性。定量螢火蟲熒光強度之后，再在同一樣品中加入Stop&Glo Reagent試劑，將上述反應(yīng)淬滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應(yīng)，進行第二次測量，稱之為雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐?/span>
二、應(yīng)用簡介
雙熒光素酶實驗通常用于以下研究方向:驗證miR同mRNA靶向互作。將待測mRNA的預(yù)測靶向序列插入報告基因載體，再共轉(zhuǎn)入該miR mimics，如果熒光素酶活性下降，則提示為其靶序列。驗證miR同lncRNA靶向互作。將候選的lncRNA預(yù)測靶向序列插入報告基因載體中F-Luc的3’UTR區(qū)域，檢測熒光素活性。啟動子結(jié)構(gòu)分析。將啟動子區(qū)域序列（通常2k左右）進行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c進行突變，再分別構(gòu)建入luciferase報告載體中替換啟動子序列，檢測其啟動子活性。驗證特定轉(zhuǎn)錄因子同其調(diào)控序列的作用。將該序列（通常為啟動子區(qū)域）插入報告基因載體，同時在實驗細胞中共轉(zhuǎn)過表達該轉(zhuǎn)錄因子，可分析轉(zhuǎn)錄因子過表達是否提高熒光素酶活性。
報告基因(reporter gene):是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。
一般的，把報告基因的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，從而利用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控。
在動物基因表達調(diào)控的研究中，報告基因被廣泛應(yīng)用。如綠色熒光蛋白(GFP）和熒光素酶。
熒光素酶（Luciferase）：是能夠催化不同底物氧化發(fā)光的一類酶的統(tǒng)稱，哺乳細胞無內(nèi)源性熒光素酶。
熒光素酶報告基因的優(yōu)點
1、優(yōu)越的靈敏度，比Westernbloting靈敏度高1000倍以上；
2、內(nèi)源性低，哺乳動物無內(nèi)源性表達；
3、熒光素酶檢測不受細胞內(nèi)其他物質(zhì)影響；
4、發(fā)光檢測，檢測方便；
5、靈敏度高，10‐20摩爾熒光素酶分子；
6、檢測范圍廣，大于7個數(shù)量級。
主要應(yīng)用領(lǐng)域
1、潛在啟動子/啟動子核心區(qū)域檢測；
2、潛在增強子/抑制子等調(diào)控子核心元件檢測；
3、啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點檢測；
4、啟動子/增強子與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用；
5、病毒/細胞相互作用；
6、藥物等化學(xué)誘導(dǎo)因素對啟動子活性的調(diào)節(jié)（抑制或增強）；
7、射線等物理誘導(dǎo)因素對啟動子活性的調(diào)節(jié)（抑制或增強）。
三、 實驗方法
四、樣本送檢要求
五、案例展示
六、常見問題
1、由于溫度對酶反應(yīng)有影響，所以測定時樣品和試劑均需達到室溫后再進行測定。
2、Renilla熒光素酶檢測工作液后需配制后立即使用，不可配制成工作液后長期保存。
3、Luciferase Assay Reagent II (LAR II)不能反復(fù)凍融，保證每次用同一批次的LAR II。配好的LAR II在-20度可穩(wěn)定一個月，在-70度 可穩(wěn)定一年。
4、試劑保存和使用時都應(yīng)避光。
5、為取得最佳測定效果，測定時，樣品和測定試劑混合后到測定前的時間應(yīng)盡量控制在相同時間內(nèi)（1-2秒）。
6、使用過程中切勿接觸操作屏（程序會被終止或取消）。
7、平時盡量不要移動儀器，防止觸摸屏走位。
七、服務(wù)流程
病理學(xué)檢測
分子生物學(xué)檢測
免疫學(xué)檢測服務(wù)
細胞實驗服務(wù)
動物實驗平臺
