中國(guó)自主創(chuàng)新企業(yè)
3A質(zhì)量服務(wù)誠(chéng)信企業(yè)
3A質(zhì)量服務(wù)誠(chéng)信企業(yè)
國(guó)家級(jí)科技企業(yè)孵化器
重點(diǎn)培育項(xiàng)目
重點(diǎn)培育項(xiàng)目
一、 實(shí)驗(yàn)原理
克隆形成實(shí)驗(yàn)是腫瘤細(xì)胞學(xué)研究中的一種常用技術(shù)，其原理是將細(xì)胞分離成單細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)，根據(jù)集落形成數(shù)量和大小來檢測(cè)細(xì)胞增殖能力和致瘤性。該實(shí)驗(yàn)可用來研究腫瘤細(xì)胞的增殖能力、侵襲性，探討細(xì)胞對(duì)不同殺傷因素的敏感性。
根據(jù)培養(yǎng)基是否需要軟瓊脂，克隆形成實(shí)驗(yàn)可以分為平板克隆形成實(shí)驗(yàn)（PCF）和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)（SACF）。PCF是直接將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿中，優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便、細(xì)胞間分泌的促生長(zhǎng)因子可在培養(yǎng)液中擴(kuò)散、克隆形成率高，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞;缺點(diǎn)為細(xì)胞在 貼壁前易于移動(dòng)。SACF是采用半固體培養(yǎng)基模擬體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，適用于懸浮細(xì)胞及不依賴于貼壁生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞。在懸浮狀態(tài)下不能增殖的細(xì)胞（如正常成纖維細(xì)胞）不適用此法。
軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)主要用于非貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，某些細(xì)胞（如正常成纖維細(xì)胞）在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于此法。某些惡性腫瘤細(xì)胞，不僅在貼壁狀態(tài)下能增殖，在懸浮狀態(tài)下能增殖，其在軟瓊脂中形成克隆的能力反映了惡性程度，這種方法可用于細(xì)胞分化的基礎(chǔ)研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗(yàn)等方面。讓細(xì)胞處于不貼壁以及單細(xì)胞狀態(tài)，模擬體內(nèi)細(xì)胞處于半固液態(tài)的情況，在此狀態(tài)下檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。單細(xì)胞處于soft agar中，就如胰酶消化后的狀態(tài)，及圓形，此后細(xì)胞繼續(xù)增殖、分裂，形成單克隆球形。半固體環(huán)境肯定是要求惡性程度高的容易生長(zhǎng)，所以不會(huì)比平板克隆快，只要能夠和對(duì)照比較即有意義。
克隆形成試驗(yàn)是測(cè)定細(xì)胞增殖能力的有效方法之一，貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。細(xì)胞克隆形成率表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量，可以反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。
二、應(yīng)用簡(jiǎn)介
軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)可用于：
①細(xì)胞分化的基礎(chǔ)研究；
②臨床腫瘤治療的療效檢驗(yàn)等方面。
當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，成為集落或克隆。
平板細(xì)胞克隆適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞和正常培養(yǎng)的細(xì)胞可用于：
①細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
②細(xì)胞群體依賴性檢測(cè)
三、實(shí)驗(yàn)方法
四、樣本送檢要求
五、案例展示
DU145細(xì)胞克隆形成的圖片（相機(jī)左，顯微鏡右）
六、常見問題
平板克隆實(shí)驗(yàn)
1）平板克隆形成實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。
2）實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大。
3）細(xì)胞在進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)時(shí)要求有95%以上的分散度，否則結(jié)果的準(zhǔn)確度會(huì)受到很大影響。
4）一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。
軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗(yàn)
1）軟瓊脂克隆的操作相對(duì)復(fù)雜，在實(shí)驗(yàn)過程中一定要注意無菌操作。
2）在將瓊脂于培養(yǎng)基混勻時(shí)，要注意瓊脂溫度，而且動(dòng)作要迅速，避免局部結(jié)塊。
3）制備好底層瓊脂后，要待其完全凝固后再澆上上層瓊脂。
4）通常下層1.2% Argrose快些鋪，略有不平是沒有太大關(guān)系的，上層0.7% Argrose與細(xì)胞混合時(shí)水浴不大于40度，小心均勻的鋪，37度不會(huì)那么快凝固，孵箱里過幾天就好了。
5）軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于不貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大，接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。
6）軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)。
七、服務(wù)流程
病理學(xué)檢測(cè)
分子生物學(xué)檢測(cè)
免疫學(xué)檢測(cè)服務(wù)
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)服務(wù)
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)
