中國(guó)自主創(chuàng)新企業(yè)
3A質(zhì)量服務(wù)誠(chéng)信企業(yè)
3A質(zhì)量服務(wù)誠(chéng)信企業(yè)
國(guó)家級(jí)科技企業(yè)孵化器
重點(diǎn)培育項(xiàng)目
重點(diǎn)培育項(xiàng)目
一、實(shí)驗(yàn)原理
Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無(wú)聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。
濾膜孔徑一般為8um，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過(guò)，必須分泌水解酶，并通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)才能穿過(guò)這種鋪有Martrigel的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。
鋪有Martrigel的濾膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之間，鋪有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趨化劑，如一定濃度的LN、FN或小鼠3T3條件培養(yǎng)液或人睪丸上皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，上室加入重懸的瘤細(xì)胞，具有侵襲能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下開(kāi)始穿膜運(yùn)動(dòng)。細(xì)胞穿膜所用的時(shí)間與Martrigel的用量有關(guān)，選擇25ugMartrigell鋪膜，16小時(shí)后觀察結(jié)果較為合適。穿過(guò)濾膜的細(xì)胞多數(shù)粘附在濾膜下表面，可用棉簽將上表面的細(xì)胞拭去，然后用乙醇固定濾膜，PE染色，在光鏡下觀察統(tǒng)計(jì)穿過(guò)Martrigel的細(xì)胞數(shù)。另外用Transwell小室也可進(jìn)行重建基質(zhì)膜侵襲分析，這一方法是在Transwell小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel，加入細(xì)胞72h后觀察結(jié)果。值得注意的是，細(xì)胞在TransWll腔中培養(yǎng)72小時(shí)后，有相當(dāng)數(shù)量穿過(guò)濾膜的細(xì)胞不再粘附在濾膜下表面，而是脫落進(jìn)人下腔溶液中．因此統(tǒng)計(jì)穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)目時(shí)應(yīng)把這部分細(xì)胞考慮在內(nèi)。腫瘤細(xì)胞穿過(guò)重建基質(zhì)膜的能力與它的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，可以用重建基質(zhì)膜模型初篩抗侵襲藥物。
在上述分析中，如果不在膜上鋪Martrigel而直接將8um孔徑濾膜安放在侵襲腔室上下腔室之間，細(xì)胞通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)穿過(guò)濾膜，用這種模型對(duì)分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和藥物對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。另外，在下室中加有LN或FN或在濾膜下表面鋪上LN或FN，可分析藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的趨化性或趨固性的影響。
二、應(yīng)用簡(jiǎn)介
腫瘤細(xì)胞通過(guò)膜表面特定受體與基質(zhì)或基底膜的層粘連蛋白、纖維連接蛋白和IV型膠原等相粘連，然后腫瘤細(xì)胞可釋放蛋白水解酶或激活基質(zhì)中已存在的酶原，使基質(zhì)成分降解，最后腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)而充填到被水解了的基質(zhì)的空隙處，如此三個(gè)過(guò)程不斷重復(fù)腫瘤細(xì)胞不斷向深層侵襲。
腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（TumourInvasionAssay）可應(yīng)用于：
（1）研究各種細(xì)胞因子對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響；
（2）一些抑制血管生成的新藥研究；
（3）研究腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制。
三、實(shí)驗(yàn)方法
Step1：制備條件培養(yǎng)基
Step2：包被基底膜
Step3：水化基底膜
Step4：接種細(xì)胞
Step5：培養(yǎng)細(xì)胞
Step6：固定及染色
Step7：鏡檢
四、樣本送檢要求
五、案例展示
圖一
圖二
六、常見(jiàn)問(wèn)題
1、24孔板下室一般加入600ul的培養(yǎng)基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡， 要將小空提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板；
2、接種的細(xì)胞應(yīng)選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好，細(xì)胞計(jì)數(shù)需準(zhǔn)確；
3、待細(xì)胞遷出，且形態(tài)展開(kāi)后即可固定染色；
4、染色后，可用棉簽輕輕擦掉上層未遷出細(xì)胞；
5、拍照時(shí)，同一視野不可重復(fù)拍照，膜上小孔清晰，細(xì)胞形態(tài)明顯，所有照片的背景需統(tǒng)一。
七、服務(wù)流程
病理學(xué)檢測(cè)
分子生物學(xué)檢測(cè)
免疫學(xué)檢測(cè)服務(wù)
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)服務(wù)
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)
