一、實(shí)驗(yàn)原理
穩(wěn)轉(zhuǎn)株即穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，指的是基于某一細(xì)胞系構(gòu)建的持續(xù)過表達(dá)或干擾某特定基因的細(xì)胞系。慢病毒感染-藥物篩選法是目前廣泛應(yīng)用的穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建方法，具有高效整合、目標(biāo)細(xì)胞廣泛等特點(diǎn)。
將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標(biāo)志進(jìn)行篩選。最常用的真核表達(dá)載體的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，篩選得到可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，或者穩(wěn)定表達(dá)沉默特定基因的細(xì)胞株。
二、應(yīng)用簡(jiǎn)介
穩(wěn)轉(zhuǎn)株主要應(yīng)用于以下研究中：
1、需要長期在目的細(xì)胞中研究基因功能。通過構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也方便長期的實(shí)驗(yàn)研究；
2、部分蛋白半衰期及長，瞬時(shí)RNA只能干擾表達(dá)，無法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白，通過構(gòu)建穩(wěn)定株可以實(shí)驗(yàn)更好的基因干擾效果；
3、瞬轉(zhuǎn)會(huì)引入不可預(yù)期的拷貝數(shù)表達(dá)（往往瞬時(shí)表達(dá)較高），導(dǎo)致因?yàn)槿藶橐蛩卦斐蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果的不精確，構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選到拷貝數(shù)適量的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；
4、穩(wěn)轉(zhuǎn)株可以用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)，用于控制基因的時(shí)空表達(dá)；
5、需要用目的細(xì)胞構(gòu)建動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)，往往需要構(gòu)建成穩(wěn)定株。
三、實(shí)驗(yàn)方法
1、目的細(xì)胞的合適抗生素濃度篩選；
2、目的細(xì)胞的合適病毒滴度篩選；
3、慢病毒構(gòu)建與包裝與滴度測(cè)定；
4、慢病毒感染；
5、特定抗生素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；
6、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株鑒定。
四、樣本送檢要求
五、案例展示
多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株
單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株
六、常見問題
1.支原體污染問題
由于輕度的支原體污染并不影響細(xì)胞的生長和增殖，故被許多實(shí)驗(yàn)室所忽略。但支原體易在病毒感染細(xì)胞后爆發(fā)，出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，導(dǎo)致穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的失敗。我們建議在穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建之初，務(wù)必排除細(xì)胞及培養(yǎng)環(huán)境中的支原體污染。
2.其他問題
除支原體污染之外，還有以下問題會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)于穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建中。
七、服務(wù)流程
病理學(xué)檢測(cè)
分子生物學(xué)檢測(cè)
免疫學(xué)檢測(cè)服務(wù)
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)服務(wù)
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)
