一、 實驗原理
原位雜交技術(shù)的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。為顯示特定的核酸序列必須具備3個重要條件：組織、細胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補的核苷酸序列(即探針)、有與探針結(jié)合的標(biāo)記物。
RNA原位核酸雜交又稱RNA原位雜交組織化學(xué)或RNA原位雜交。該技術(shù)是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內(nèi)RNA表達的一種原位雜交技術(shù)。其基本原理是：在細胞或組織結(jié)構(gòu)保持不變的條件下，用標(biāo)記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則，與待測細胞或組織中相應(yīng)的基因片段相結(jié)合(雜交)，所形成的雜交體 (Hybrids)經(jīng)顯色反應(yīng)后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內(nèi)相應(yīng)的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位雜交技術(shù) 經(jīng)不斷改進，其應(yīng)用的領(lǐng)域已遠超出DNA原位雜交技術(shù)。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已成為最有效的分子病理學(xué)技術(shù)，同時在分析低豐度和罕見的mRNA表達方面已展示了分子生物學(xué)的一重要方向。
二、應(yīng)用簡介
基因組原位雜交(Genome in situ hybridization，GISH)技術(shù)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的一種原位雜交技術(shù)。它主要是利用物種之間DNA同源性的差異，用另一物種的基因組DNA以適當(dāng)?shù)臐舛茸鞣庾?，在靶染色體上進行原位雜交。GISH技術(shù)最初應(yīng)用于動物方面的研究(Pinkel et al.,1986)，在植物上最早應(yīng)用于小麥雜種和栽培種的鑒定。
熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)是在已有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性DNA分子原位雜交技術(shù)。它利用熒光標(biāo)記的核酸片段為探針，與染色體上或DNA顯微切片上的特異fl-N：~行雜交，通過熒光檢測系統(tǒng)(熒光顯微鏡)檢測信號DNA序列在染色體或DNA顯微切片上的目的DNA序列，進而確定其雜交位點。FISH技術(shù)檢測時間短，檢測靈敏度高，無污染，已廣泛應(yīng)用于染色體的鑒定、基因定位和異常染色體檢測等領(lǐng)域。FISH是原位雜交技術(shù)大家族中的一員，因其所用探針被熒光物質(zhì)標(biāo)記（間接或直接）而得名，該方法在80年代末被發(fā)明，現(xiàn)已從實驗室逐步進入臨床診斷領(lǐng)域。 基本原理是熒光標(biāo)記的核酸探針在變性后與已變性的靶核酸在退火溫度下復(fù)性；通過熒光顯微鏡觀察熒光信號可在不改變被分析對象（即維持其原位）的前提下對靶核酸進行分析。DNA熒光標(biāo)記探針是其中最常用的一類核酸探針。利用此探針可對組織、細胞或染色體中的DNA進行染色體及基因水平 的分析。熒光標(biāo)記控針不對環(huán)境構(gòu)成污染，靈敏度能得到保障，可進行多色觀察分析，因而可同時使用多個探針，縮短因單個探針分開使用導(dǎo)致的周期過程和技術(shù)障礙。
多彩色熒光原位雜交(Multicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH)是在熒光原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，它用幾種不同顏色的熒光素單獨或混合標(biāo)記的探針進行原位雜交，能同時檢測多個靶位，各靶位在熒光顯微鏡下和照片上的顏色不同，呈現(xiàn)多種色彩，因而被稱為多彩色熒光原位雜交。它克服了FISH技術(shù)的局限，能同時檢測多個基因，在檢測遺傳物質(zhì)的突變和染色體上基因定位等方面得到了廣泛的應(yīng)用。
原位雜交細胞定位和PCR的高靈敏度相結(jié)合的技術(shù)，在細胞（爬片、甩片或涂片）或組織（石蠟、冰凍切片）上直接對靶基因片段進行擴增，通過摻入標(biāo)記基團直接顯色或結(jié)合原位雜交進行檢測的方法。
三、 實驗流程
四、樣本送檢要求
五、案例展示
六、 常見問題
1、RNA探針長度以50-150bp為佳，探針已進入細胞，雜交率高，雜交時間短。
2、原位雜交反應(yīng)中探針濃度應(yīng)超過靶序列的濃度，探針濃度必須給予該實驗最大信噪比，因為背景著色度高低與探針濃度有關(guān)。
3、雜交溫度應(yīng)低于解鏈或溶解溫度20-30℃。雜交反應(yīng)的時間可隨探針濃度的增加而縮短，雜交時間過短會造成雜交不完全，雜交時間過長會增加非特異性著色。
4、組織固定或蔗糖脫水不好會使組織有較多的空泡。
七、 服務(wù)流程
病理學(xué)檢測
分子生物學(xué)檢測
免疫學(xué)檢測服務(wù)
細胞實驗服務(wù)
動物實驗平臺
