一、實(shí)驗(yàn)原理
DNA甲基化存在于大多數(shù)真核生物中，一般發(fā)生在CpG雙核苷酸中胞嘧啶的5’UTR區(qū)，起調(diào)控作用。CpG的胞嘧啶大概有80%被甲基化，20%處于基因調(diào)控區(qū)的CpG島中。
DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá)，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。脊椎動(dòng)物DNA的甲基化狀態(tài)與生長發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)，比如在腫瘤發(fā)生時(shí)，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)的下降。
BSP甲基化測序（Bisulfite Genomic Sequencing PCR）的原理通過對(duì)基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，非甲基化的胞嘧啶被脫氨基而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，在隨后的PCR反應(yīng)中尿嘧啶轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能被脫氨基，在反應(yīng)完成時(shí)被保留，我們將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆測序，可以分析甲基化發(fā)生的具體情況。該方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性高，是甲基化檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。
二、 應(yīng)用簡介
在惡性腫瘤的發(fā)展中，甲基化的狀態(tài)并不是一成不變，腫瘤細(xì)胞內(nèi)全基因組的低甲基化程度與疾病進(jìn)展、腫瘤大小和惡性程度都有密切的關(guān)系，DNA甲基化檢測對(duì)腫瘤惡性程度的判斷有重要意義。
三、 實(shí)驗(yàn)方法
四、 樣本送檢要求
五、案例展示
六、常見問題
1、蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml；
2、RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在購買市售RNA酶后進(jìn)行再處理，配制成10mg/ml。
3、驗(yàn)證提取DNA的純度的方法有二：紫外分光光度計(jì)計(jì)算OD比值；2：1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。第二種方法可以完全明確所提基因組DNA的純度，并根據(jù)Marker的上樣量估計(jì)其濃度，以用于下一步的修飾。
4、基因組DNA的量不需十分精確，寧多勿少，因?yàn)樵谝院蠹兓厥詹襟E中會(huì)有丟失，且此方法修飾最多可至4ug。
5、所有試劑均須新鮮配制，所以配液的技術(shù)要過關(guān)，既要快，又要精確。
6、亞硫酸氫鈉溶液呈強(qiáng)酸性，一定用堿將PH調(diào)制5.0，否則PH不合適會(huì)影響后續(xù)純化吸收。
7、水浴最好達(dá)16小時(shí)，雖可以短至8小時(shí)，但后者修飾會(huì)有不完全。?
8、在使用注射器時(shí)，一定要用力均勻且輕，如使用暴力，會(huì)將小柱內(nèi)的薄膜擠破，失去作用。?
9、乙酸銨、糖原不需新鮮配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸銨室溫即可，因?yàn)檫@樣濃度的乙酸銨非常難溶，一旦放在4度，取出用時(shí)也會(huì)有很多溶質(zhì)析出。
10、異丙醇、70%乙醇都不需要新鮮配制，但如果用量大，現(xiàn)場配也很方便。?此步關(guān)鍵是在樹脂與DNA的結(jié)合上，這就再次強(qiáng)調(diào)第二部分調(diào)亞硫酸鈉PH值得重要性。因?yàn)闃渲cDNA結(jié)合需要有一個(gè)適當(dāng)?shù)腜H，如前一步?jīng)]做好，此步樹脂不能與DNA很好結(jié)合，將會(huì)帶來災(zāi)難性后果，即DNA隨著液體被擠出了，洗脫時(shí)實(shí)際已沒有任何DNA了。??
11、PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，要使用新配的電泳液。凝膠濃度1%-2%均可。
12、凝膠DNA回收時(shí)在300nm紫外燈下觀察條帶位置，切取目的片斷所在位置的凝膠，盡量小，保證特異性。
13、紫外照射時(shí)間不能過長，否則對(duì)DNA有損傷。?
14、回收后的DNA如不馬上用就儲(chǔ)存于-20度，在數(shù)月內(nèi)是很穩(wěn)定的。???
15、涂板要均勻，保證Xgar和IPTG均勻分布在板面上；?
16、不要讓藍(lán)白斑長得太滿，否則選取克隆時(shí)容易一下挑2個(gè)。?
七、服務(wù)流程
病理學(xué)檢測
分子生物學(xué)檢測
免疫學(xué)檢測服務(wù)
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)服務(wù)
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)
