技術(shù)原理
aqMan探針法核心是探針分子，TaqMan探針是單鏈DNA，5’端偶聯(lián)發(fā)光基團，3’端偶聯(lián)淬滅基團，游離的完整探針是檢測不到熒光信號的，發(fā)光基團發(fā)出的熒光會被淬滅基團吸收淬滅，探針被水解，發(fā)光基團和淬滅基團遠離就可以檢測到熒光信號。反應(yīng)開始時，模板鏈經(jīng)熱變性解鏈形成單鏈，TaqMan探針優(yōu)先跟模板鏈退火，引物隨后退火到模板上，之后進行鏈的延伸，延伸過程中Taq酶發(fā)揮5’-3’外切酶活性，遇到探針會從5’端逐個堿基切除探針，發(fā)光基團會跟淬滅基團分開，因此熒光檢測系統(tǒng)可以接收到熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號的累積和PCR產(chǎn)物形成是同步的。
TaqMan探針法的特異性除了由引物提供，更由探針分子保證，因其退火溫度更高，所以TaqMan探針法特異性更好，在一個反應(yīng)體系中加入多條探針，可以做多個基因同時檢測。
實驗方法原理
實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。
實時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最終通過相對定量或絕對定量的方法確定各個樣本的本底表達量。qPCR檢測常用的兩種方法：染料法和TaqMan探針法。
1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
2.TaqMan探針法：
探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。
相關(guān)應(yīng)用
1.臨床疾病診斷
各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測實現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現(xiàn)遺傳病診斷。
禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。
食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測。
醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。
各級各類醫(yī)療機構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。
由于qPCR是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨到優(yōu)勢。
五、案例展示
六、 常見問題
1) 引物設(shè)計
1、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；
2、Taqman探針技術(shù)要求片段長度在50bp-150bp；
3、避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)。避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對；
4、典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性，較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%；
5、引物之間的Tm值相差避免超過2°C；
6、引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基；
7、為避免基因組的擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子；
8、探針位置盡可能地靠近上游引物；
9、探針的5'端應(yīng)避免使用堿基G，引物的3’端避免使用堿基A。探針長度通常在25~35bp，Tm值在65~70°C ,通常比引物Tm高5 ~10°C，GC含量在40%~ 70%；
10、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量；
11、為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在Blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。
2) 熱啟動
熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。
3) 鎂離子濃度
鎂離子影響PCR的多個方面，如：對DNA聚合酶的活性的影響進而影響產(chǎn)量;對引物退火的影響，進而影響特異性。若dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，則降低了酶活性所需要的游離鎮(zhèn)離子的量。
4) 模板質(zhì)量
模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中可能有多種污染物會抑制PCR。
5) 防止殘余污染
1、PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增。當(dāng)前一次擴增產(chǎn)物用來進行新的擴增反應(yīng)時，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其它樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源(非殘余污染)。
2、可以在PCR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染。為PCR樣品配制和擴增后分析設(shè)計隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套?？偸鞘褂貌缓心０宓年幮詫φ諜z測污染。使用預(yù)先混合的反應(yīng)成份，而不是每個反應(yīng)的每個試劑單獨加入。
七、服務(wù)流程
病理學(xué)檢測
分子生物學(xué)檢測
免疫學(xué)檢測服務(wù)
細胞實驗服務(wù)
動物實驗平臺
